Komponenter i lysis buffere

Lyse er et ord, der kommer fra græsk og betyder blot "at splitte" eller "at briste." Det er en rimelig beskrivelse af, hvad der sker med celler i en lyseringsbuffer en opløsning, der bryder dem åbne at udtrække deres indhold. Forskere bruger lysis buffere, når ekstraktion af DNA eller proteiner fra celler til analyse, især i tilfælde af bakterier. Den type celle lysis buffer varierer afhængigt af typen af ​​eksperimentet, selvom følgende er nogle almindelige valg.

Buffer og Salt

Buffere stabilisere pH, mens cellerne bliver lyseret. Tris-HCL er en fælles buffer som buffer ved pH 8; hvis der ønskes pH, HEPES er en anden almindelig buffer kemikalie i disse eksperimenter. Natriumchlorid salt kan også inkluderes for at øge ionstyrken, den totale koncentration af opløste stoffer uden for cellerne. Det sidste er vigtigt, da vand kan diffundere over cellemembraner fra områder med lav koncentration af opløst stof til regioner med høj koncentration af opløst stof.

Vaskemiddel

Vaskemiddel er den vigtigste ingrediens, der opløser cellemembranen, så indholdet kan slippe ud. Rengøringsmidler er amfipatiske molekyler, dvs, molekyler med den ene ende, der interagerer let med vandmolekyler, mens den anden hydrofobe eller "vand-frygte" ende ikke gør. De kan opløse fedtstoffer ved at danne miceller, små klynger, hvor de hydrofobe haler af detergentmolekylerne peger indad mod fedtmolekyler. Fælles detergenter indbefatter natriumdodecylsulfat eller SDS, NP-40 og Triton.

Chelateringsmidler og Inhibitorer

Lysis buffere indbefatter typisk også chelateringsmidler såsom ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) eller ethylenglycol-tetraeddikesyre (EGTA). Disse kemikalier binder sig til metalioner med +2 ladning (fx magnesium og calcium) og derved gøre dem utilgængelige for andre reaktioner. Mange DNAser (proteiner, der tygge op DNA) og proteaser (proteiner, skive op andre proteiner) har brug for magnesiumioner at fungere, så ved at fratage dem denne vigtig ingrediens, EDTA og EGTA hjælp til at reducere niveauet af protease eller DNase aktivitet. De behøver ikke udelukke det helt, dog, og nogle proteaser afhænger ikke magnesium cofaktorer, så lysis buffere til tider også indeholde kemikalier kaldet proteasehæmmere, som binder til proteaser og forhindre dem i at fungere korrekt.

Alkalisk lyse

Alkalisk lyse er en meget almindelig teknik til oprensning af plasmider fra bakterier. Denne fremgangsmåde involverer tre løsninger. Den første indeholder glucose, Tris-HCI-buffer, EDTA og RNAser. Glucosen skaber en høj koncentration af opløst stof uden for bakterierne, så de bliver lidt slasket, hvilket gør dem lettere at lysere; EDTA og Tris-HCI funktion som allerede beskrevet, medens RNAse vil tygge op enhver RNA inde i cellen for at få det ud af vejen. Den anden løsning faktisk lyserer cellerne. Denne ene indeholder SDS vaskemiddel og NaOH, hvilket rejser pH til 12 eller derover, denaturering proteiner inde i cellen og forårsage DNA adskilles i enkelte strenge. Den tredje opløsning indeholder kaliumacetat at genoprette pH til et mere neutralt niveau, så plasmidet DNA-strenge kan komme tilbage sammen. I mellemtiden de denaturerede proteiner klumper op og udfældes, mens dodecyl- sulfationer kommer sammen med kaliumioner at danne en uopløselig forbindelse, som også udfældes fra opløsning.