Sådan Design Primere til kloning
Primere er korte, enkeltstrengede syntetiske DNA-fragmenter anvendt til kloning. Polymerasekædereaktionen (PCR) anvendt til kloning består af tre trin: denaturering (DNA'et af interesse er adskilt i to separate strenge), annealing (primeren tillægger genet af interesse) og forlængelse (DNA-polymerase forlænger primeren til klon DNA'et af interesse). God primer design er afgørende for effektiv kloning. Der er mange faktorer at tage i betragtning ved udformningen af den optimale primer til din gen af interesse.
Vejledning
Faktorer at overveje, når designe primere
• Vælg en sektion af basepar i begyndelsen og slutningen af din gen til din frem og reverse primere. Hver primer vil supplere deres respektive afsnit. Husk, er DNA syntetiseret fra 5'-enden til 3'-enden, så din 5 'forward primer skal være et supplement til din nederste streng, og din 3 "reverse primer skal være gratis for din top streng.
• Design primeren være 18-21 nucleotider i længden. Dette hjælper med at forhindre ikke-specifik binding af primeren sikre sekvensen er komplementær til én sektion, men stadig indeholder tilstrækkelig længde til at anneale korrekt.
• Design primere til at have en smeltetemperatur på 50-60 grader Celsius. En forenklet formel til beregning af smeltetemperaturen af en primer er T = 2 (A + T) + 4 (G + C).
• Design primere, så de indeholder 40-60 procent af G- og C-nukleotider. Dette sikrer, at smeltetemperaturen er høj nok. Sørg for at smeltetemperaturer i hvert primerpar er inden for 5 grader af hinanden.
• Undgå komplementaritet af to eller tre baser i 3'-enderne af primerne. Dette reducerer primer-dimer-dannelse, som opstår, når primere anneale til hinanden i stedet for til genet af interesse.
• Design en GC klemme i dine primere. Put G og C baser inden for de sidste fem baser fra 3'-enden af hver primer. Dette hjælper med at fremme specifikke binding ved 3'-enden. Dette skyldes stærkere binding af G og C baser. Undgå mere end tre G eller C er i de sidste fem baser i 3'-enden af hver primer.
• Undgå at lægge et T ved 3'-enden af primeren. Disse primere har en større mismatch tolerance.
• Undgå træk gentagelser af 2 basepar (dinukleotid gentagelser), da dette kan forårsage mispriming. Fire eller færre dinukleotid gentagelser er ideelle.
• Undgå strækninger af en enkelt base, da det også kan forårsage mispriming. Undgå mere end fire gentagne baser i en række.