Sådan Beregn udglødningstemperaturer

November 10

Sådan Beregn udglødningstemperaturer

Beregning Annealing temperatur er afgørende for succes i en polymerasekædereaktion (PCR) procedure. Dette er fordi en præcis temperatur er nødvendig for DNA-primer til at fastgøre til DNA-prøven. Primeren tillader DNA-replikation ved fastgørelse komplementære nukleotider til den enkeltstrengede DNA, der effektivt fordobler en given DNA-prøve, der giver mulighed for en lille DNA prøve at blive omdannet til en prøve stor nok til analyseformål, såsom i retsvidenskab. Hele denne proces kan svigte eller producere sub-par resultater, hvis den korrekte annealingstemperatur ikke anvendes.

Instruktioner


• Find eller bestemme nukleotidsekvensen af ​​primeren eller primere, der vil blive anvendt i PCR-reaktionen.

• Tæl antallet af hver type nukleotid i primersekvensen. For eksempel i en tyve nucleotider lang enkelt streng af DNA-primer, der kunne være fem thymin, syv adenin, cytosin fire og fire guanin.

• Sæt nukleotidnumrene i denne ligning: Temp = 4 (G + C) + 2 (A + T) ° C

• Beregn efter indsættelse værdier. T: 5, A: 7, C: 4, G: 4 Temp = 4 (4 + 4) + 2 (7 + 5) C Temp = 32 + 24 = 13,3 ° C Celsius

• Fratræk den beregnede temperatur med to til fem grader Celsius for at bestemme den annealingstemperatur for primeren i PCR-reaktionen. Dette er nødvendigt, da beregningen i det foregående trin resulterer i smeltetemperaturen for en primer. Annealingstemperatur en primer er typisk 2-5 grader Celsius lavere end dens smeltetemperatur. Ifølge University of Cape Town, "Man bør sigte mod anvendelse af en annealing temperatur (Ta) omkring 5 grader under den laveste Tm af parret af primere, der skal anvendes."

• Subtraher 2-5 grader fra primeren med den laveste smeltetemperatur, som vil blive anvendt i PCR. Typisk to forskellige primere, der anvendes i PCR-proceduren, så det er vigtigt at bestemme, hvilken primer har den laveste smeltetemperatur for at beregne den korrekte annealingstemperatur.